常規(guī)反相分析色譜柱柱清洗與再生的推薦步驟：
壓力升高，色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分離度降低，這些都強(qiáng)烈提示色譜柱受到污染。可采用以下步驟處理：
1. 如系統(tǒng)接有在線過濾器和保護(hù)柱，首先排查在線過濾器與保護(hù)柱，進(jìn)行更新替換。日常操作中，當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時，就應(yīng)考慮更換在線過濾器和/或保護(hù)柱。
2. 使用高比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗(請注意避免鹽析出，通常可使用梯度升高法，然后維持在高比例甚至100%有機(jī)溶劑條件下)。此操作通常可洗去大部分污染物。
3. 如有機(jī)溶劑清洗不能解決問題，可采用如下方法進(jìn)行色譜柱的清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)以及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法，用20倍柱體積(即，對于4.6x250 mm柱，相當(dāng)于80 mL)的HPLC級溶劑清洗色譜柱，將流動相溫度升至35-55℃可提高清洗效率。
極性樣品 | 非極性樣品 | |
1.水 | 1.異丙醇* | 選擇1：連續(xù)進(jìn)幾針DMSO(二甲基亞砜)，以溶解柱頭析出樣品 |
2.甲醇 | 2.THF** | |
3.THF* | 3.二氯甲烷** | 選擇2：10-90%B梯度沖洗，其中A為0.1%TFA水溶液，B為0.1%TFA乙腈。 |
4.甲醇 | 4.正己烷 | |
5.水 | 5.異丙醇 | 選擇3：使用7M鹽酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜過濾)沖洗色譜柱，促使柱上吸附蛋白樣品變性溶解。 |
6.流動相 | 6. 流動相 |
* 注意防止緩沖鹽析出，可調(diào)整為適當(dāng)比例的異丙醇和水的混合溶液
** 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機(jī)溶劑如乙腈清洗干凈時才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和正己烷中的暴露時間。
4. 可以考慮對色譜柱進(jìn)行倒沖，特別是當(dāng)問題表現(xiàn)為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時。操作時，將色譜柱倒接，并與檢測器斷開。使用低流速0.2 ml/min，進(jìn)行過夜沖洗，并封堵檢測器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡。甚或，將色譜柱小心的打開，直接更換柱入口端篩板。注意！這類操作需要技巧，僅作問題確實(shí)無法得到有效解決時的最后嘗試，或供某些經(jīng)驗(yàn)豐富的分析操作人員參考使用。
